Cas9

Η Cas9 (CRISPR associated protein 9, που παλαιότερα ονομαζόταν Cas5, Csn1 ή Csx12) είναι μια πρωτεΐνη 160 kilodalton, η οποία διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στην ανοσολογική άμυνα ορισμένων βακτηρίων έναντι ιών DNA και πλασμιδίων και χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό σε εφαρμογές γενετικής μηχανικής. Η κύρια λειτουργία της είναι να κόβει το DNA και έτσι να μεταβάλλει το γονιδίωμα ενός κυττάρου. Η τεχνική επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9 συνέβαλε σημαντικά στην απονομή του βραβείου Νόμπελ Χημείας το 2020 στις Emmanuelle Charpentier και Jennifer Doudna^[1].

Πιο τεχνικά, η Cas9 είναι ένα ένζυμο διπλής RNA-καθοδηγούμενης DNA-ενδονουκλεάσης που σχετίζεται με το προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) στον Streptococcus pyogenes^[2][3][4]. O S. pyogenes χρησιμοποιεί την CRISPR για να απομνημονεύσει και την Cas9 για να ανακρίνει και να διασπάσει αργότερα ξένο DNA, όπως DNA εισβάλλοντος βακτηριοφάγου ή πλασμιδιακό DNA.^[4][5][6] Η Cas9 εκτελεί αυτή την ανάκριση ξετυλίγοντας το ξένο DNA και ελέγχοντας για θέσεις συμπληρωματικές προς την περιοχή διαστήματος 20 νουκλεοτιδίων του οδηγού RNA (gRNA). Εάν το υπόστρωμα DNA είναι συμπληρωματικό προς το οδηγό RNA, η Cas9 διασπά το εισβάλλον DNA. Υπό αυτή την έννοια, ο μηχανισμός CRISPR/Cas9 έχει αρκετές αντιστοιχίες με τον μηχανισμό παρέμβασης RNA (RNAi) στους ευκαρυώτες.

Εκτός από την αρχική της λειτουργία στη βακτηριακή ανοσία, η πρωτεΐνη Cas9 έχει χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό ως εργαλείο μηχανικής του γονιδιώματος για την επαγωγή κατευθυνόμενων κατά τόπους σπασιμάτων διπλής έλικας στο DNA.

Αυτές οι διακοπές μπορούν να οδηγήσουν σε απενεργοποίηση γονιδίων ή στην εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων μέσω της μη ομόλογης σύνδεσης άκρων και του ομόλογου ανασυνδυασμού αντίστοιχα σε πολλούς εργαστηριακούς οργανισμούς-μοντέλα. Η έρευνα για την ανάπτυξη διαφόρων παραλλαγών της cas9 αποτέλεσε έναν πολλά υποσχόμενο τρόπο για την υπέρβαση του περιορισμού της επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9. Ορισμένα παραδείγματα περιλαμβάνουν τη νικάση Cas9 (Cas9n), μια παραλλαγή που επάγει μονόκλωνες ρήξεις (SSBs) ή παραλλαγές που αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες PAM^[7] Παράλληλα με τις νουκλεάσες με δάκτυλο ψευδαργύρου και τις πρωτεΐνες TALEN (transcription activator-like effector nuclease), η Cas9 εξελίσσεται σε εξέχον εργαλείο στον τομέα της επεξεργασίας γονιδιώματος.

Η Cas9 έχει κερδίσει έδαφος τα τελευταία χρόνια επειδή μπορεί να διασπάσει σχεδόν οποιαδήποτε αλληλουχία συμπληρωματική προς το RNA-οδηγό^{[2] [4]}Επειδή η εξειδίκευση στόχου της Cas9 προέρχεται από τη συμπληρωματικότητα RNA-οδηγού:DNA και όχι από τροποποιήσεις της ίδιας της πρωτεΐνης (όπως οι TALEN και οι δάκτυλοι ψευδαργύρου), η μηχανική Cas9 για να στοχεύει νέο DNA είναι απλή^[8] Εκδόσεις της Cas9 που δεσμεύουν αλλά δεν διασπούν το συγγενικό DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό μεταγραφικών ενεργοποιητών ή καταστολέων σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA, προκειμένου να ελέγχεται η ενεργοποίηση και η καταστολή της μεταγραφής^{[9] [10]}Το εγγενές Cas9 απαιτεί ένα RNA-οδηγό που αποτελείται από δύο διαφορετικά RNA που συνδέονται - το CRISPR RNA (crRNA) και το trans-ενεργοποιητικό crRNA (tracrRNA)^[3]. Η στόχευση του Cas9 έχει απλοποιηθεί μέσω της μηχανικής ενός χιμαιρικού ενιαίου RNA-οδηγού (chiRNA). Οι επιστήμονες έχουν προτείνει ότι οι γονιδιακές μονάδες που βασίζονται στο Cas9 μπορεί να είναι ικανές να επεξεργαστούν τα γονιδιώματα ολόκληρων πληθυσμών οργανισμών^[11].Το 2015, το Cas9 χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για την τροποποίηση του γονιδιώματος ανθρώπινων εμβρύων^[12].